实验原理：在生物医学研究中，原代细胞培养是从动物机体提取各种组织后，通过胰蛋白酶等酶、EDTA等螯合剂或机械方法处理，将其分散为单个细胞，并放置于合适的培养基中，以支持细胞的存活、生长和繁殖。细胞在培养瓶内形成致密的单层后，将达到基本饱和。因此，为了促进细胞的持续生长并扩大细胞数量，必须进行传代培养（再培养）。传代培养不仅是保存细胞株的重要手段，也是开展各类实验的必要步骤。对于悬浮型细胞，可以直接分瓶，而贴壁细胞则需经过消化处理后进行分瓶操作。

实验仪器包括：培养箱（设定在37℃）、培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机及水浴箱（37℃）。所需的实验试剂包括：1640培养基或DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、Hank’s液、碘酒及75%酒精。

实验步骤：

一、原代细胞培养步骤

1. 准备：在净化台面上布置已消毒的培养用品，并进行紫外线消毒20分钟。操作前，要彻底洗手并用75%酒精消毒手部至肘部。

2. 布局：点燃酒精灯并安装吸管帽。

3. 处理组织：将组织块放入烧杯中；用Hank’s液漂洗2-3次去除血污。如有污染风险，可先在含青链霉素的溶液中浸泡30-60分钟。

4. 剪切：用眼科剪将组织剪成2-3毫米的块，便于消化。加入30-50倍的胰蛋白酶液，倒入三角烧瓶中并密封。

5. 消化：在恒温水浴或37℃温箱中进行消化，每20分钟轻摇一次。消化时间取决于组织块的大小和硬度。

6. 分离：当消化液变混浊时，抽取少量观察细胞状态，一旦观察到细胞团或单个细胞形成，立即终止消化，并使用不锈钢筛滤去未消化的组织块。进行低速离心（500-1000转/分）5分钟，吸出上清，加入含血清的培养液。

7. 计数：使用计数板计数细胞密度。如过高，调整后分装入培养瓶。绝大多数细胞的培养液pH需在7.2-7.4范围内，培养液呈微红色；若颜色偏黄则需用NaHCO3调节。

8. 培养：放入37℃温箱中培养。在CO2培养箱中时，瓶口需用纱布或棉塞封闭，以防霉菌滋生。

二、原代组织块培养法

1. 剪切：将小组织块放入小烧杯中，用Hank’s液漂洗以去除表面血污，再用眼科剪剪成1毫米块。

2. 摆布：用吸管吸取小块，放置于培养瓶底部，保持0.5cm的间距，每25ml培养瓶可放置20-30块。

3. 翻转：轻轻翻转瓶子，底部向上，注意防止小块滑动，塞好瓶塞，放入37℃温箱培养约2小时。

4. 培养：取出培养瓶，开塞，倾斜瓶身轻轻注入培养液，覆盖组织块，培养至细胞从组织中游出增加后再补加培养液。

三、贴壁细胞传代操作步骤

1. 吸除旧培养液。

2. 加入胰蛋白酶和EDTA混合液，覆盖瓶底。

3. 在温箱中放置2-5分钟，观察细胞质收缩和间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，加入Hank’s液，轻轻冲洗去残余消化液。若用胰蛋白酶消化可直接加入培养液，无需冲洗。

5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁，使细胞从瓶壁脱离，形成细胞悬液。

6. 计数后，将细胞悬液分装入多个培养瓶中放入温箱培养。

四、悬浮型细胞传代

1. 吸出细胞培养液，离心于1000rpm，5分钟。

2. 吸掉上清液，加入适量新鲜培养基，混合均匀后按照稀释比例转移至新的培养瓶，保持正常培养条件。

注意事项

1. 操作前洗手，进入超净台后需用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦拭。试剂瓶口也要擦拭。

2. 点燃酒精灯，操作应在火焰附近进行，耐热物品需经常烧灼。金属器械的烧灼时间应适量，以免退火。

3. 操作时要迅速准确，以减少空气流动和污染的风险。

4. 避免用手触碰已消毒的器皿工作部分，保持工作台干净整齐。

5. 瓶子开口后，尽量保持在45°斜位。

6. 吸取溶液的吸管等器具不得混用。

通过以上步骤，操作人员可以在生物医学领域有效地进行细胞培养、传代和实验，为科学研究及医疗应用提供可靠的基础。以XPJ品牌的细胞培养技术，确保细胞培养过程的安全和高效。提升实验室水平，助力生物医学研究的开展。